ADN recombinante artificial

Se han utilizado varias técnicas recombinantes para la fabricación de proteínas en grandes cantidades y poderlas implementar en el tratamiento de enfermedades. La mayoría de cambios son incluidos a nivel post-traduccional. Así, en el caso del ictus isquémico, se ha diseñando el activador de plasminógeno de

la sangre tPA llamado también alteplasa, que es una molécula que participa en el

proceso de degradación de los coágulos de la sangre.

El proceso industrial involucra la secreción de la enzima (proteasa de la serina) Alteplase al medio 

de cultivo a través de células de Ovario de Hámster Chino (CHO) modificadas genéticamente 

obteniendo con ello una producción y calidad significativa para uso terapéutico, lo cual, apunta a la 

preparación de cultivos de fermentación que sean explotados comercialmente.

Los procesos que deben desarrollarse para obtener una proteína pura  para 

uso farmacéutico son los siguientes

 •  Fermentación 

•  Eliminación de biomasa  

•  Concentración 

•  Purificación  

•  Acabado 

La alteplasa recombinante es una enzima fibrinolítica utilizada para la disolución de los coágulos sanguíneos en los pacientes con  accidente cerebrovascular isquémico agudo. Elaborado mediante tecnología recombinante de ADN, este fármaco que disuelve los coágulos también se denomina activador del plasminógeno tisular recombinante (rt-PA).

http://www.youtube.com/watch?v=9GXTtc-NP48

Webgrafía
http://www.arrakis.es/~ibrabida/vigcorte.html
http://aportes.educ.ar/biologia/nucleo-teorico/influencia-de-las-tic/tecnologia-del-adn-recombinante/que_es_la_tecnologia_del_adn_r.php
http://zl.elsevier.es/es/revista/nursing-20/autoevaluacion-alteplasa-13076895-cuidados-criticos-2005?bd=1

ADN recombinante en la naturaleza

El ADN recombinante que no se obtiene a partir de técnicas moleculares desarrolladas en laboratorios se conoce como RECOMBINACIÓN GENÉTICA, que ocurre de normalmente en la naturaleza, ejemplos de este tipo de recombinación tenemos:

• - recombinación en la reproducción viral
• - recombinación por transformación bacteriana
• - cambio de clase de inmunoglobulinas
• - conversión génica
• - recombinación no homóloga

webgrafía

http://es.scribd.com/doc/70708591/Recombinacion-genetica
http://darwin.usal.es/profesores/pfmg/sefin/MI/tema10MI.html

Técnica de hibridación de las enfermedades cerebrovasculares

·      Hibridación:valora la presencia de fragmentos con una secuencia de nucleótidos concreta. Incluye las técnicas de Southern blot (ADN), Northern blot (ARN).

Procedimiento experimental

1.    La hélice de doble cadena (ADN) se separa mediante un proceso físico (calor) o químico (con una base fuerte, como la sosa cáustica). Esto rompe los enlaces por puente de hidrógeno que mantienen unidas las dos hebras del ADN.

2.    Las dos hebras complementarias se separan, el ADN se desnaturaliza.

3.    Una muestra de cadenas simples (o desnaturalizadas) se mezcla con otra muestra de cadenas simples.

4.    La muestra combinada se enfría lentamente, las moléculas sencillas se van emparejando por las zonas complementarias (más establestermodinámicamente) y se va formando una nueva molécula hibridada

La velocidad de hibridación es un indicativo de la similaridad genética entre las dos muestras. El porcentaje de similaridad genómica y la velocidad de hibridación es directamente proporcional.

Webgrafía

http://www.neurowikia.es/content/diagn%C3%B3stico-anatomopatol%C3%B3gico-y-t%C3%A9cnicas-de-biolog%C3%AD-molecular-en-tumores-primarios-del-sn

http://www.cnic.es/doc/otri/catalogo_capacidades_es.pdf

PCR en enfermedades cerebovasculares

Proteína C-reactiva (PCR) es la más conocida entre las proteínas de fase aguda, un grupo de proteínas cuya concentración aumenta en la sangre como respuesta a las enfermedades inflamatorias. El hígado produce esta proteína en respuesta a la infección, lesión de los tejidos y la inflamación.Un número creciente de estudios han examinado que una prueba más sensible, el llamado PCR-us (PCR de alta sensibilidad) puede predecir brotes de la enfermedad cardiovascular, accidente cerebrovascular y muerte en diferentes entornos. Los altos niveles de PCR-us consistentemente predecir eventos coronarios recurrentes en pacientes con angina inestable e infarto agudo de miocardio.
Rango de medición
Ensayo Inmunoturbidimétrico: 

Suero / Plasma: 0,25-40mg / l, CV <6,0%
De sangre entera: 0,50-40mg / l, CV <9,0%

Principio:

Determinación cinética de la concentración de CRP en la medición fotométrica a 546 nm y 700 nm de la reacción antígeno-anticuerpo entre anticuerpos humanos CRP unido a partículas de poliestireno y la PCR en la muestra.

Duración de la prueba:

Duración de la prueba dura aprox. 3 minutos de medición en suero, aproximadamente. 4 minutos la medición de la sangre entera.

Tipos:

Con respecto a los análisis para cuantificar los niveles de PCR, en la actualidad existen dos tipos de exámenes: 
1) La prueba estándar, la cual mide en un rango más amplio los niveles de PCR en la sangre, pero que pierde sensibilidad con niveles bajos de la proteína
2) La prueba denominada PCR ultrasensible, la cual mide con mayor precisión los valores bajos de PCR y es mucho más sensible. De esta manera, con el examen de PCR estándar es posible el diagnóstico de estados de inflamación pronunciados con patologías ya establecidas (sólo reporta valores de PCR mayores a 3mg/L), mientras que gracias a la sensibilidad y precisión del examen de PCR ultrasensible (reporta niveles tan bajos como hasta de 0.1mg/L) puede predecirse el riesgo que tiene una persona sana a padecer enfermedades que involucren inflamación

Los resultados de PCR ultrasensible pueden ser categorizados de acuerdo al riesgo de enfermedades cardiovasculares en:

• Personas con riesgo bajo: < 1mg/L.
• Personas con riesgo intermedio: entre 1mg/L y 3mg/L.
• Personas con riesgo alto: > 3mg/L

Webgrafía:

http://o.elobot.es/descubrir-riesgos-ocultos-del-corazon/proporcionando-mayor-claridad-a-las-pruebas-de-pcr

http://roewebnews.com/tag/pcr-ultrasensible/

Diagnóstico de leptospirosis mediante la PCR en pacientes con síndrome febril ictorohemorrágico

La leptospirosis (enfermedad de Weil oictericia de Weill ) es una enfermedad febril producida por la Leptospira interrogans, una bacteria del orden Spirochaetales, de la familia Leptospiraceae.
Los principales síntomas en la mayoría de los casos sonfiebre, cefalea, dolores musculares, articulares y óseos, ictericia, insuficiencia renal, hemorragias y afectación de las meninges. 
Existen diferentes métodos de diagnóstico como: la MAT que se emplea para diagnosticas anticuerpos leprospira en el suero pero con el pasar del tiempo se desarrollaron mas pruebas, el ensayo ELISA, el Dispstick y el Dri Dot.

Materiales y Métodos:
25 cepas patógenas y no patógenas de referencia internacional, cedidas por el Rpyal Tropical Institute de Holanda, se subcultivaron a 30ºC en medio EMJH AL 10%.

Muestras de pacientes:
Se recolectaron muestras de suero y orina de 73 pacientes provenientes de diferentes regiones de Venezuela, a los cuales se les realizó el diagnóstico diferencial entre patologías como manifestaciones clínicas compatibles con los SFIH

Extracción de ADN:

1.- Lisis: Centrifugación a 12000 rpm y lavados con PBS, mezcla con buffer de lisis y se incubó a 56ºC durante 2h.
2.- Separación: Fenol-cloroformo-alcohol isoamílico .
3.- Purificación: se resuspendió en buffer TE ( 10 mM Tris-HCL ph 7.5 , 1 mM EDTA) se almacenó a 4ºC hasta el momento del uso.
4.-Análisis: Se evaluó mediante procedimientos convencionales usando tablas de 2x2 considerando la MAT como prueba de referencia con un resultado de PCR positivo en orina y/o suero considerados como verdaderos positivos.

Bibliografía:
Cardona Noelia, Moros María Rosalba, López Eneida A, Pérez José Luis, Hernández Carlos Roberto, "Diagnóstico de leptospirosos mediante la PCR en pacientes con síndrome icterohemorrágico" Instituto Nacional de Higiene " Rafael Rangel", Caracas-Venezuela, 25 de enero del 2008

Webgrafía:
http://www.nlm.nih.gov/medlineplus/spanish/ency/article/001376.htm
http://es.wikipedia.org/wiki/Leptospirosis
http://epi.minsal.cl/epi/html/enfer/leptospirosis.html

Traducción

Tomando en cuenta la transcripción la traducción también representa un grado de alteración al momento de la expresión de los genes jugando un papel muy importante en la recuperación, uno de los genes que se observó que sufría cambios en su expresión tras una isquemia cerebral era:

IEG (Immediate Early Genes): son activados transitoriamente y de forma rápida en respuesta a una gran variedad de estímulos celulares, es activado a nivel de la transcripción para posteriormente sintetizarse en nuevas proteínas, estos van a cumplir una función reguladora.

La concentración de Ca2+ en la célula, se produce una alteración en la homeostasis celular por la vía de la fosforilación de las proteínas y un incremento de las concentraciones de óxido nítrico (ON) y producción de radicales de oxígeno. El resultado final de esta actividad enzimática anormal es la pérdida en la integridad del citoesqueleto, daño mitocondrial y, finalmente, formación de radicales de oxigeno, que producen daño neuronal por ataque directo a las estructuras vasculares, o por ataque a los componentes moleculares de la célula, principalmente el núcleo.

 Los radicales libres, provocan rupturas de DNA, desnaturalización de proteínas, edema, lesión del endotelio, aumento de la permeabilidad vascular, peroxidación de los lípidos de membrana y alteraciones de la función mitocondrial.

Webgrafría:

http://www.tdx.cat/bitstream/handle/10803/3591/nbb1de1.pdf?sequence=1

http://bvs.sld.cu/revistas/med/vol43_4_04/med08404.htm

Transcripción con las Enfermedades Cereborvasculares

La obesidad es un factor de riesgo de enfermedades coronarias, de cáncer, de accidentes cerebrovasculares y  de diabetes tipo II. El ácido valproico, tricostatin A y resveratrol reduzcen la diferenciación de preadipocitos. Los dos primeros, inhiben la actividad de las histonas deacetilasas tipo I y II, mientras que el resveratrol es un activador de la enzima sirtuina 1 perteneciente a la familia  de las histonas deacetilasas dependientes de dinucleótidos de nicotinamida adenina. Esta reprime la actividad  trascripcional mediada por el receptor de proliferación del peroxisoma mediante su asociación con represores, evidenciado en la movilización de ácidos grasos en células adiposas.

Otro mecanismo sugerido es que TSA promueve la apoptosis en células cancerosas, retardando la progresión del cáncer .El papel de la actividad HDAC en la diferenciación  del adipocito no está bien definido. Sin embargo, trabajos  recientes han estudiado su inhibición en la activación  transcripcional de los genes adipogénicos in vitro,  incluidas la proteína potenciadora de unión a CCAAT  (C/EBP), el receptor de proliferación del peroxisoma  (PPARg), y la proteína de unión regulada por elementos  esteroides SREBP



Webgrafía

http://www.unicolmayor.edu.co/invest_nova/NOVA/artorig3_NOVA11.pdf